【摘要】 与ChIP-seq相比较,这些方法无需获取可溶性染色质进行免疫共沉淀,具有实验流程简单、耗时短等优势,可以在少量细胞或单细胞水平进行检测。
染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)包含细胞裂解、细胞核提取、染色质制 备以及免疫共沉淀等多个连续步骤,需要的细胞量较大,常规ChIP-seq很难进行少量细胞或单细胞水平的检测。随着近几年来生物领域技术的巨大突破,研究人员利用目的蛋白特异性抗体使MNase或Tn5转座酶“靶向”作用于目的蛋白结合位点附近的染色质,提出CUT&RUN、CUT&Tag等方法。与ChIP-seq相比较,这些方法无需获取可溶性染色质进行免疫共沉淀,具有实验流程简单、耗时短等优势,可以在少量细胞或单细胞水平进行检测。
Schmid等人建立了以酶“靶向”切割染色质的方法:ChIC(chromatin immunocleavage)。为使MNase选择性地作用于目的蛋白结合区域,研究者利用对抗体具有亲和力的Protein A融合MNase(pAMN),通过抗体结合pA-MN融合蛋白将MNase间接结合到目的蛋白。在ChIC实验中,首先利用螯合剂EDTA、EGTA等抑制MNase酶活性,将细胞与含有目的蛋白特异性抗体、pA-MN的缓冲液反应后,用Ca2+激活MNase,使其在特定位点断裂DNA。2016年,Skene和Henikoff小组将ChIC与高通量测序技术结合,提出CUT&RUN。
CUT&RUN中,特异性抗体先与目的蛋白结合,进一步与pA-MN反应,募集pA-MN到结合位点。在0℃下保持较低的酶活性,抗体固定酶后,采用Ca2+激活MNase使其在目的蛋白结合位点附近作用于染色质开放区域,酶切后染色质片段释放,进一步建库测序。2018年,Skene等人对CUT&RUN 实验优化,通过洋地黄皂苷(digitonin)增加细胞膜通透性,释放酶切染色质片段到细胞外,由于未被切割的染色质仍留在细胞内,有利于降低背景噪音。
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